Флуоресцентни филтер је суштинска компонента у флуоресцентном микроскопу. Типичан систем има три основна филтера: ексцитациони филтер, емисиони филтер и дихроично огледало. Обично се пакују у коцку тако да се група убацује заједно у микроскоп.
Како функционише флуоресцентни филтер?
Филтер ексцитације
Филтери за побуђивање емитују светлост одређене таласне дужине и блокирају друге таласне дужине. Могу се користити за производњу различитих боја подешавањем филтера тако да прође само једна боја. Филтери за побуђивање долазе у два главна типа — дугопропусни филтери и филтери опсега. Побуђивач је обично пропусни филтер који пропушта само таласне дужине које апсорбује флуорофор, чиме се минимизира ексцитација других извора флуоресценције и блокира ексцитационо светло у опсегу емисије флуоресценције. Као што је приказано плавом линијом на слици, БП је 460-495, што значи да може проћи само кроз флуоресценцију од 460-495 нм.
Постављен је унутар путање осветљења флуоресцентног микроскопа и филтрира све таласне дужине извора светлости осим опсега ексцитације флуорофора. Минимални пренос филтера диктира осветљеност и сјај слике. Препоручује се најмање 40% преноса за било који филтер побуде, тако да је пренос идеално >85%. Ширина опсега ексцитационог филтера треба да буде у потпуности унутар опсега побуђивања флуорофора тако да је централна таласна дужина (ЦВЛ) филтера што је ближа вршној таласној дужини побуђивања флуорофора. Оптичка густина филтера побуде (ОД) диктира таму слике у позадини; ОД је мера колико добро филтер блокира таласне дужине изван опсега преноса или пропусног опсега. Препоручује се минимални ОД од 3,0, али је идеалан ОД од 6,0 или већи.
Емисиони филтер
Емисиони филтери служе за омогућавање жељене флуоресценције из узорка да стигне до детектора. Блокирају краће таласне дужине и имају високу трансмисију за дуже таласне дужине. Тип филтера је такође повезан са бројем, нпр. БА510ИФ на слици (филтер баријере интерференције), та ознака се односи на таласну дужину на 50% његовог максималног преноса.
Исте препоруке за филтере побуде важе и за емисионе филтере: минимални пренос, пропусни опсег, ОД и ЦВЛ. Емисиони филтер са идеалном комбинацијом ЦВЛ, минималног преноса и ОД обезбеђује најсветлије могуће слике, са најдубљим могућим блокирањем и обезбеђује детекцију најслабијих сигнала емисије.
Дицхроиц Миррор
Дихроично огледало је постављено између ексцитационог филтера и емисионог филтера под углом од 45° и рефлектује побудни сигнал према флуорофору док емитује сигнал емисије ка детектору. Идеални дихроични филтери и разделници снопа имају оштре прелазе између максималне рефлексије и максималног преноса, са >95% рефлексије за пропусни опсег филтера побуђивања и преносом од >90% за пропусни опсег емисионог филтера. Изаберите филтер имајући на уму таласну дужину пресека (λ) флуорофора, да бисте минимизирали расуто светло и максимизирали однос сигнала и шума флуоресцентне слике.
Дихроично огледало на овој слици је ДМ505, названо тако јер је 505 нанометара таласна дужина на 50% максималног преноса за ово огледало. Крива трансмисије за ово огледало показује високу трансмисију изнад 505 нм, стрм пад у трансмисији лево од 505 нанометара и максималну рефлексивност лево од 505 нанометара, али ипак може имати неки пренос испод 505 нм.
Која је разлика између дугопропусних и појасних филтера?
Флуоресценцијски филтери се могу поделити у два типа: дугопропусни (ЛП) и банд-пас (БП).
Дугопропусни филтери емитују дуге таласне дужине и блокирају оне краће. Таласна дужина пресека је вредност на 50% вршне трансмисије, а све таласне дужине изнад пресека се преносе помоћу дугопропусних филтера. Често се користе у дихроичним огледалима и емисионим филтерима. Лонгпасс филтере треба користити када апликација захтева максимално прикупљање емисије и када спектрална дискриминација није пожељна или неопходна, што је генерално случај за сонде које генеришу једну емитујућу врсту у узорцима са релативно ниским нивоом позадинске аутофлуоресценције.
Појасни филтери преносе само одређени опсег таласне дужине, а блокирају друге. Они смањују преслушавање дозвољавајући само најјачи део емисионог спектра флуорофора да се пренесе, смањују шум аутофлуоресценције и на тај начин побољшавају однос сигнал-шум у узорцима аутофлуоресценције високе позадине, што дугопропусни филтери не могу да понуде.
Колико типова комплета флуоресцентних филтера БестСцопе може да испоручи?
Неки уобичајени типови филтера укључују плаве, зелене и ултраљубичасте филтере. Као што је приказано у табели.
| Сет филтера | Филтер ексцитације | Дицхроиц Миррор | Барриер Филтер | ЛЕД лампа Ваве Ленгтх | Апликација |
| B | БП460-495 | ДМ505 | БА510 | 485нм | ·ФИТЦ: Флуоресцентна метода антитела ·Ацидин наранџаста: ДНК, РНК ·Аурамин: бацил туберкулозе ·ЕГФП, С657, РСГФП |
| G | БП510-550 | ДМ570 | БА575 | 535нм | · Родамин, ТРИТЦ: Флуоресцентна метода антитела · Пропидијум јодид: ДНК ·РФП |
| U | БП330-385 | ДМ410 | БА420 | 365нм | · Опсервација аутофлуоресценције ·ДАПИ: ДНК бојење ·Хоецхест 332528, 33342: користи се за бојење хромозома |
| V | БП400-410 | ДМ455 | БА460 | 405нм | ·Катехоламини ·5-хидрокси триптамин · Тетрациклин: Скелет, Зуби |
| R | БП620-650 | ДМ660 | БА670-750 | 640нм | ·Ци5 ·Алека Флуор 633, Алека Флуор 647 |
Сетови филтера који се користе у аквизицији флуоресценције су дизајнирани око главних таласних дужина које се користе у флуоресцентним апликацијама, које се заснивају на најчешће коришћеним флуорофорима. Из тог разлога, они су такође названи по флуорофору за који су намењени за снимање, као што су ДАПИ (плава), ФИТЦ (зелена) или ТРИТЦ (црвена) филтер коцке.
| Сет филтера | Филтер ексцитације | Дицхроиц Миррор | Барриер Филтер | ЛЕД лампа Ваве Ленгтх |
| ФИТЦ | БП460-495 | ДМ505 | БА510-550 | 485нм |
| ДАПИ | БП360-390 | ДМ415 | БА435-485 | 365нм |
| ТРИТЦ | БП528-553 | ДМ565 | БА578-633 | 535нм |
| ФЛ-Аурамине | БП470 | ДМ480 | БА485 | 450нм |
| Текас Ред | БП540-580 | ДМ595 | БА600-660 | 560нм |
| мЦхерри | БП542-582 | ДМ593 | БА605-675 | 560нм |
Како одабрати флуоресцентни филтер?
1. Принцип одабира флуоресцентног филтера је да флуоресцентно/емисионо светло прође кроз крај за снимање што је даље могуће и да истовремено потпуно блокира ексцитационо светло, како би се добио највећи однос сигнал-шум. Посебно за примену мултифотонске ексцитације и микроскопа укупне унутрашње рефлексије, слаб шум ће такође изазвати велике сметње ефекту слике, тако да је захтев за однос сигнала и шума већи.
2. Познавати ексцитациони и емисиони спектар флуорофора. Да би се конструисао сет флуоресцентних филтера који генерише слику високог квалитета, високог контраста са црном позадином, филтери ексцитације и емисије треба да постигну високу трансмисију са минималним таласањем опсега пропусности преко региона који одговарају пиковима побуде флуорофора или емисијама.
3. Размотрите трајност флуоресцентних филтера. Ови филтери морају бити непропусни за интензивне изворе светлости који генеришу ултраљубичасто (УВ) светло које може довести до „сагоревања“, посебно филтера узбуђивача пошто је изложен пуном интензитету извора осветљења.
Различите флуоресцентне слике узорака
Ресурси се прикупљају и организују на Интернету и користе се само за учење и комуникацију. Ако постоји било какво кршење, контактирајте нас да га избришемо.
Време поста: 09.12.2022